AKTIVITAS SINERGIS BERBAGAI ENZIM KITINASE PADA Serratia marcescens

1. PENDAHULUAN

 

• Latar Belakang

Kemelimpahan limbah cangkang udang sebagai hasil dari industri pembekuan udang di Indonesia belum dimanfaatkan secara makasimal. Berdasarkan data BPS, produksi total udang dan kepiting dari Indonesia rata-rata mencapai setidaknya 160.000 ton/tahun. Dengan asumsi bahwa 25 persen dari berat tersebut adalah cangkangnya, maka limbahnya dapat mencapai 40.000 ton/tahun. Salah satu produk yang dihasilkan dari pemanfaatan cangkang udang yaitu N-asetilglukosamin  (NAG). NAG dihasilkan melalui reaksi hidrolisis kitin dengan bantuan enzim kitinase.

Kitinase merupakan enzim yang dapat mengkatalis reaksi pemecahan senyawa polimer kitin menjadi oligomer kitin dan monomer kitin seperti N-asetilglukosamin  (NAG). Pemanfaatan senyawa N-asetilglukosamin  (NAG) saat ini banyak digunakan di bidang pangan dan farmasi. Khusniati et al. (2012) menyatakan bahwa pemanfaatan NAG  pada bidang industri pangan  yaitu sebagai suplemen produk susu  ultra high temperature  atau UHT. Menurut Wirawan dan Nuniek (2013) pemanfaatan NAG pada bidang farmasi yaitu sebagai obat untuk mengontrol kadar gula dalam darah, sebagai suplemen, dan anti inflamantori. Untuk kosmetik, senyawa gula ini dapat membantu mengurangi hilangnya hiperpigmentasi, karena N-asetilglukosamin dapat membantu mengurangi aktivitas enzim tirosinase yang berperan dalam produksi melanin. Degradasi kitin oleh kompleks kitinase bekerja secara sinergis yaitu, endokitinase mendegradasi polimer menjadi oligomer dengan menghidrolisis ikatan glikosida β-(1,4) kemudian eksokitinase mendegradasi oligomer menjadi monomer yang bekerja pada ujung pereduksi, sedangkan β-N-asetilglukosaminidase memotong unit NAG (Bhattacharya et al., 2007).

Serratia marcescens adalah bakteri gram negatif dari famili Enterobacteriaceae. Bakteri ini berbentuk basil (bulat lonjong) dan beberapa galur membentuk kapsul, termasuk organisme yang bergerak dengan cepat (motil) karena mempunyai flagela peritrik, dapat tumbuh dalam kisaran suhu 5℃-40℃ dan dalam kisaran pH antara 5-9. Serratia marcescens adalah salah satu bakteri yang dapat menghasilkan enzim kitinase. Penelitian Chakrabortty et al. (2012) menunjukkan bahwa bakteri Serratia marcescens mampu menghasilkan aktivitas kitinase tertinggi pada pH 7 yaitu sebesar 10,12 U/mL. Aktivitas kitinase Serrratia marcescens tersebut tergolong tinggi. Menurut Brurberg et al. (2000) Serratia marcescens dapat memproduksi  lebih dari 1 jenis kitinase, yaitu kitinase A, kitinase B dan kitinase C. Menurut Horn et al. (2006) Serratia marcescens juga dapat memproduksi enzim kitinase C. Ketiga enzim kitinase yang dihasilkan oleh S. marcescens memiliki karakteristik spesifik dan aktivitas yang sinergis dalam mendegradasi kitin. Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan oleh Suzuki et al. (2002), menunjukan bahwa sinergisme terjadi pada kombinasi antara ChiA, ChiB atau ChiC dan disebutkan bahwa sisi aktif substrat ketiga kitinase tersebut berbeda. Kitinase ChiA dan ChiB berperan sebagai eksokitinase sedangkan ChiC sebagai endokitinase. Selain ketiga enzim tersebut, terdapat protein yang turut andil dalam membantu proses degradasi kitin menjadi produk hidrolisatnya. Protein tersebut antaralain CBP (Chitin Binding Protein) dan Chitobiase (chb). CBP dapat meningkatkan efisiensi saat proses degrades i kitin sedangkan Chitobiase (Chb) diperlukan untuk mendegradasi kitin menjadi GlcNAc secara sempurna. Meskipun penting dalam degradasi kitin, hanya sedikit penelitian yang membahas tentang aktivitas Chb di kombinasi dengan kitinase dan CBP.

Memahami aktivitas sinergis berbagai enzim kitinase dapat meningkatkan produk hasil hidrolisat dari kitin seperti NAG. Kombinasi spesifik enzim kitinase dibutuhkan untuk mendapatkan produk akhir degradasi kitin yang diinginkan. Oleh karena itu makalah ini membahas mengenai aktivitas sinergis berbagai jenis enzim kitinase pada Serratia marcescens serta kombinasi spesifik enzim tersebut dengan CBP (Chitin Binding Protein) dan Chitobiase (chb) untuk menghasilkan produk trimer, dimer dan monomer yang optimal.

 

• Tujuan

1. Mengetahui aktivitas sinergis berbagai enzim kitinase pada Serratia marcescens dalam menghasilkan produk hidrolisatnya.
2. Mengetahui mekanisme sinergis berbagai enzim kitinase pada Serratia marcescens.

 

• Manfaat

Makalah ini diharapkan dapat memberi informasi mengenai aktivitas sinergis berbagai enzim kitinase pada Serratia marcescens dalam menghasilkan produk hidrolisatnya beserta mekanismenya.

1. PEMBAHASAN

 

• Kitin

Kitin adalah senyawa polimer yang tersusun atas monomer N-asetilglukosamin dan dihubungkan oleh ikatan β-1,4 glikosida. Beberapa jenis hasil perikanan yang menjadi sumber kitin diantaranya yaitu cangkang udang, cangkang kepiting, tulang cumi-cumi dan alga (Yurnaliza, 2002). Menurut Muzzarelli (1999), kitin dapat  dibedakan  berdasarkan susunan N-Asetilglukosaminnya  yaitu α-kitin (antiparalel), β-kitin (paralel) dan γ-kitin (antiparalel-paralel). α-kitin mempunyai susunan N-Asetilglukosamin lebih rapat serta lebih sering dijumpai di alam, sedangkan β-kitin mempunyai susunan N-Asetilglukosamin yang tidak rapat dan banyak dijumpai pada cangkang moluska. Struktur γ-kitin merupakan gabungan dari α-kitin dan β-kitin yang memiliki susunan N-Asetilglukosamin rapat dan N-Asetilglukosamin tidak rapat.

Berdasarkan sifat fisikanya kitin merupakan bahan yang mirip dengan sellulosa yang sama-sama memiliki sifat dalam hal kelarutan dan reaktifitas yang rendah. Kitin berwarna putih, keras, tidak elastis, dan mengandung nitrogen. Kitin dapat larut dalam HCl, H₂SO₄, H₃PO₄, dikoloroasetat, trikloroasetat dan asam formiat. Kitin juga larut dalam larutan garam netral yang dipanaskan (Synowiecki & Al-Khateeb, 2003). Berdasasrkan sifat kimianya kitin dapat dianggap sebagai basa lemah, oleh karena itu dapat mengalami reaksi netralisasi sebagai senyawa yang bersifat alkali (Taranathan & Kittur,2003). Struktur kimia kitin ditunjukan pada Gambar 2.1.

Gambar 2.1 Struktur kimia kitin (Murray et al., 2003)

• Kitinase

Kitinase termasuk dalam kelas enzim Glycoside hydrolases berdasarkan fungsinya. Glycosyde hydrolases merupakan kelompok enzim yang dapat menghidrolisis ikatan glikosidik pada glikosida (Naumoff, 2011). Kitinase adalah enzim yang menghidrolisis senyawa kitin pada β-1,4-N-Asetil-glukosamin menjadi monomer N-Asetil-D-glukosamin  yang  terdistribusi di alam (Pratiwi et al., 2015). Kitinase dapat dihasilkan oleh bakteri dan jamur yang diperoleh dari berbagai sumber seperti tanah atau perairan dengan cara menumbuhkan pada media yang mengandung koloidal kitin. Struktur kitinase mempunyai lebih dari satu domain sehingga strukturnya dikenal sebagai multi-domain, yaitu domain katalitik, domain pengikatan kitin dan domain fibronektin III. Menurut Davies dan Bernard (1995) kitinase pada Serratia marcescens masuk dalam golongan GH18. Menurut Ohno  et al. (1996), kitinase dikelompokkan menjadi dua famili  berdasarkan kesamaan urutan asam aminonya, yaitu:

1. Famili 18

Famili 18 kitinase terdapat pada bakteri, jamur, virus, hewan dan tanaman tingkat  tinggi (kelas III dan V). Kitinase ChiA, ChiB dan ChiC termasuk kedalam family 18.

2. Famili 19

Famili 19 kitinase pada awalnya hanya ditemukan pada tanaman tingkat tinggi  (kelas I, II dan IV). Selanjutnya  Streptomyces griseus  dilaporkan sebagai  organisme pertama yang memiliki enzim kitinase famili 19 selain pada tanaman  tingkat tinggi.

 

Menurut Muzzarelli (1999)  kitinase  terbagi  menjadi 3 jenis berdasarkan mekanisme kerjanya , yaitu  antaralain :

1. Endokitinase (EC.3.2.1.14)

Endokitinase (EC.3.2.1.14) yaitu enzim yang memotong secara acak ikatan β-1,4 bagian internal mikrofibril kitin. Endokitinase (EC.3.2.1.14) akan mendegradasi kitin secara acak dari dalam menghasilkan oligomer pendek N-asetilglukosamin.

2. Eksokitinase (EC.3.2.1.52)

Eksokitinase (EC.3.2.1.52) yaitu enzim yang pemotongannya hanya terjadi pada ujung non reduksi mikrofibril kitin serta tidak secara acak. Eksokitinase atau kitobiosidase, mengkatalisis pembebasan N-asetil-glukosamin atau unit dimmer kitobiosa (β-1,4-N-asetil-glukosamin);

3. β-1,4-N-Asetilglukosaminidase (EC.3.2.1.30)

β-1,4-N-Asetilglukosaminidase (EC.3.2.1.30) adalah enzim yang bekerja pada pemutusan diasetilkitobiosa, kitotriose dan kitotetraose dengan menghasilkan monomer-monomer N-Asetilglukosamin.

 

• Kitinase Serratia marcescens

Serratia marcescens merupakan salah satu bakteri yang mampu memproduksi kitinase. Serratia marcescens dapat memproduksi  lebih dari 1 jenis kitinase, yaitu kitinase A (ChiA), kitinase B (ChiB) dan kitinase C (ChiC) (Brurberg et al., 2000). Jenis-jenis kitinase dan CBP yang dihasilkan oleh Serratia marcescens ditunjukan pada Tabel 2.1 .

Tabel 2.1 Jenis-jenis kitinase dan CBP Serratia marcescens

Nama Protein	Lokasi	Berat Molekul (kDa)	Jenis Kitinase	Sumber
Kitinase A (Chi A) Kitinase B (Chi B)   Kitinase C (Chi C) Chitobiase (chb) CBP	Ekstraseluler Periplasm/ ekstraseluler Ekstraseluler Periplasm Ekstraseluler	57 53   52 93 21	Eksokitinase Eksokitinase   Endokitinase N-asetilglukosamidase	Brurberg et al., 2000   Gutiérrez-Román et al., 2014

 

Kitinase A (Chi A), Kitinase C (Chi C) dan CBP (Chitin Binding Protein) ditemukan di membrane luar sel atau ekstraseluler. Chitobiase (chb) ditemukan di periplasm yatitu sebuah ruang yang memisahkan antara membran dalam dan membrane luar. Kitinase B (Chi B) ditemukan pada periplasm atau ekstraseluler. Berat molekul dari Kitinase A (Chi A), Kitinase B (Chi B), Kitinase C, Chitobiase dan CBP masing-masing sebesar 57 kDa, 53 kDa, 52 kDa, 93 kDa, dan 21 kDa. Kitinase A (Chi A) dan Kitinasae B (Chi B) merupakan eksokitinase sedangkan Kitinase C (Chi C) merupakan endokitinase. Sementara Chitobiase merupakan jenis dari N-asetilglukosamidase.

Kitinase ChiA, ChiB dan ChiC termasuk kedalam famili 18 dalam pengelompokannya berdasarkan kesamaan urutan asam aminonya. Menurut Suzuki et al. (2002) ChiA adalah exoenzyme yang menurunkan polimer dari ujung pereduksinya. ChiA memiliki aktivitas spesifik yang tinggi dengan chitooligosaccharides dan insoluble chitin. ChiB memiliki afinitas yang kecil pada pembentukan kitin dan tinggi pada chitotriose (GlcNAc)₃. Sedangkan ChiC paling aktif pada kitin dalam bentuk soluble. CBP dapat meningkatkan degradasi chitin menjadi lebih efisien bersama ChiA, ChiB dan ChiC. Pada proses degradasi ß-chitin (substrat yang tidak larut), CBP memodifikasi struktur substrat sehingga dapat memberi akses yang lebih tinggi untuk enzim. Chitobiase (Chb) diperlukan untuk mendegradasi kitin menjadi N-asetilglukosamin secara sempurna.

 

• Mekanisme Hidrolisis Kitin oleh Enzim Kitinase

Kitinase merupakan enzim yang aktif mengkatalisis polimer kitin menjadi kitin oligosakarida atau monomer N-asetilglukosamin. Proses hidrolisis kitin melibatkan dua jenis kitinase yaitu eksokitinase dan endokitinase (Gooday, 1990).  Degradasi kitin oleh kompleks kitinase bekerja secara sinergis yaitu, endokitinase mendegradasi polimer menjadi oligomer dengan menghidrolisis ikatan glikosida β-(1,4) kemudian eksokitinase mendegradasi oligomer menjadi monomer yang bekerja pada ujung pereduksi, sedangkan β-N-asetilglukosaminidase memotong unit NAG (Bhattacharya et al., 2007). Proses hidrolisis kitin oleh kitinase ditunjukan pada Gambar 2.2

Gambar 2.2 Proses hidrolisis kitin oleh kitinase (Bhattacharya et al., 2007)

 

• Aktivitas Sinergis pada Berbagai Kombinasi Kitinase Serratia marcescens

Suzuki (2002) melakukan penelitian mengenai peran masing-masing gen ChiA, ChiB dan ChiC S.marcescens 2170 terhadap degradasi kitin. Gen ChiA dan ChiB tersebut diklon pada E.coli DH5α sedangkan gen ChiC diklon pada E.coli JM109. Masing-masing hasil kloning dimurnikan dengan gel filtrasi dan ditentukan berat molekulnya, sifat enzim serta sinergisme terhadap degradasi kitin. Degradasi kitin dilakukan dengan mencampurkan 0,2 koloidal kitin dan 60 µm chitiooligosakarida  dan 5 pmole kitinase dalam 0,1 M sodium phosphate buffer yang diinkubasi pada suhu 37℃. Kemudian campuran tersebut dipanaskan selama 5 menit dan disaring menggunakan membrane selulosa asetat dan diukur reduksi gulanya menggunakan HPLC (High-pressure Liquid Chromatography). Hasil yang diperoleh menunjukkan sinergisme yang jelas pada saat menghidrolisis koloidal kitin terjadi kombinasi antara ChiA dan ChiB atau ChiC dan disebutkan bahwa sisi serangan substrat ChiA diduga berbeda dari ChiB dan ChiC. Sinergisme antara ketiga kitinase tersebut ditunjukan pada Gambar 2.3

Gambar 2.3 Efek sinergis dari ChiA, ChiB dan ChiC terhadap degradasi Kitin.

Gambar 2.3 menunjukan reduksi gula setelah perlakuan pemberian kitin bubuk dengan berbagai kombinasi dari ChiA, ChiB dan ChiC. Sebanyak 0,2% kitin bubuk dicampurkan dengan ketiga enzim kitinase (masing-masing sebanyak 5µg). Proses reduksi gula terjadi setelah dilakukan inkubasi dengan suhu 37℃ selama 4 jam. Grafik menunjukan bahwa kombinasi antara ChiB dan ChiC tidak menunjukan adanya aktivitas sinergis. Hal tersebut diakibatkan karena ChiB dan ChiC memiliki aktivitas hidrolisis yang rendah pada insoluble substrat, berbeda halnya dengan ChiA yang memiliki aktivitas hidrolisis tertinggi diantara ketiga enzim kitinase ketika pada insoluble substrat atau substrat yang tidak larut. ChiA menempel pada sisi aktif substrat yang berbeda dengan ChiB maupun ChiC. ChiA dapat menghidrolisis kristal kitin secara efektif dari ujung rantai kitin.  Sementara kombinasi antara ChiA dan ChiB serta ChiA dan ChiC meningkatkan reduksi gula masing-masing 80% dan 45%. Ketika ketiga kitinase dikombinasikan, kenaikan dari reduksi gula hampir 100%. Menurut Aalten et al. (2001) sinergisme yang terjadi antara Chi Adan ChiB disebabkan karena adanya endoactivity begitupula pada kombinasi ChiA dan ChiC. Menurut Brurberg et al. (2000), ChiA memiliki endo-activity yang dibuktikan melalui pengamatan bahwa ChiA dapat menghasilkan monomer NAG dari kitin. Dengan demikian ChiA mungkin dapat menjadi chitobiosidase pada beberapa aktivitasa endochitinase. Hal tersebut dapat terjadi dengan catatan Exo-activity dari ChiA telah menyebabkan degradasi rantai kitin dari ujung pereduksi (berbeda dengan ChiB yang tidak dapat mereduksi atau non-reducing).

Gutiérrez-Román et al. (2014) mencoba untuk mempelajari sinergisme ketiga enzim kitinase (ChiA, ChiB, ChiC) dengan chb dan CBP. Aktivitas dari enzim kitinolitik diketahui setelah melalui proses clonning dan purifikasi pada E. coli  secara individual dan dalam kombinasi dalam campuran reaksi yang mengandung 50 mM natrium fosfat buffer (pH 6,3), 1,0% koloidal chitin (w / v) dan 5,0 µmol dari masing-masing enzim dalam volume reaksi 2,0 ml. Reaksi diinkubasi pada suhu 37 ° C dengan agitasi ringan. Setiap 2 sampai 8 jam 100µl aliquot campuran reaksi dikombinasikan dengan volume asetonitril yang sama.  Kemudian diambil 50 µl untuk dievaluasi berdasarkan produksi chitooligosakarida dari hidrolisis substrat koloidal kitin. Chitooligosakarida dideteksi menggunakan HPLC (panjang gelombang 210 nm) berupa chitotriose [trimer (GlcNAc)₃], chitobiose [dimer, (GlcNAc)₂] dan N-acetylglucosamine [monomer,(GlcNAc)]. Aktivitas kitinolitik protein rekombinan dievaluasi secara individu dan kombinasi menggunakan koloidal kitin sebagai substratnya. Kecepatan/laju produksi berupa  trimer (GlcNAc)₃, dimer (GlcNAc)₂ dan monomer (GlcNAc) pada berbagai kombinasi perlakuan ditunjukan pada Gambar 2.4.

Ket : + Menunjukan penambahan berbagai kitinase, chb dan CBP pada kombinasi perlakuan

 

Gambar 2.4 Produk akhir yang dihasilkan yaitu berupa trimer (GlcNAc)₃, dimer (GlcNAc)₂ dan monomer (GlcNAc) pada berbagai kombinasi kitinase ChiA, ChiB, ChiC, Chb dan CBP (Gutiérrez-Román et al.,2014)

 

Gambar 2.4 menunjukan bahwa perlakuan kombinasi berbagai enzim kitinase pada Serratia marcescens memiliki hasil hidrolisat lebih tinggi daripada secara individu. Kombinasi kitinase secara berpasangan (ChiA – ChiB, ChiA-ChiC, and ChiB – ChiC) menghasilkan produk timer dan dimer yang cukup tinggi namun terjadi penurunan pada monomer yang dihasilkan. Penurunan pada monomer yang dihasilkan bahkan lebih rendah dari hasil degradasi oleh kitinase ChiB dan ChiC secara individual. Tingginya produk dimer dan trimer yang dihasilkan disebabkan oleh kombinasi kitinase ChiB dan ChiC yang memiliki afinitas  umum pada substrat yang sama dan menyerang tempat yang berbeda secara bersama-sama sehingga dapat mendegradasi kitin lebih effisien. Sementara penurunan hasil monomer disebabkan oleh penghambatan enzim setelah tingginya nilai trimer dan dimer.

Efisiensi pendegradasian kitin juga dipengaruhi oleh aktivitas sinergis enzim kitinolitik dengan protein aksesori seperti Chitin Binding Protein (CPB) dan Chb. Secara individu ataupun kombinasi, CBP dan Chb (Chitobiase) tidak dapat aktif. Namun ketika dikombinasikan dengan ChiB + ChiC dapat meningkatkan laju degradasi kitin. Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan oleh Uchiyama et al. (2003), menunjukan bahwa Chb memiliki aktivitas chitobiose yang dapat mendegradasi dimer menjadi monomer. Dalam penelitian ini Chb mungkin dapat meningkatkan afinitas kitinase untuk koloidal kitin sehingga meningkatkan pembentukan dimer dan menyebabkan penghambatan substrat Chb. Efek penambahan Chb pada berbagai kombinasi kitinase terhadap hasil akhir dari produk trimer, dimer dan monomer dapat dilihat pada Gambar 2.5.

Keterangan : (a) – (c) menunjukan Kurva produksi chitooligosaccharida untuk reaksi yang mengandung Chb; (d)-(f) menunjukan Kurva produksi chitooligosaccharida untuk reaksi yang mengandung CBP.

 

Gambar 2.5 Efek sinergis penambahan Chb dan CBP terhadap produk akhir berupa trimer (GlcNAc)₃, dimer (GlcNAc)₂ dan monomer (GlcNAc) pada berbagai kombinasi kitinase ChiA, ChiB, dan ChiC (Gutiérrez-Román et al.,2014)

 

 

Kombinasi ChiA + ChiB dan ChiA + ChiC memiliki grafik produksi trimer dan monomer yang sangat mirip (Gambar 2.5). Dinamika reaksi dengan ChiB, ChiC dan ChiB + ChiC menunjukkan bahwa produksi trimer dan dimer tertinggi diperoleh selama 2 jam pertama reaksi. Fase stasioner produksi trimer dicapai pada jam ke-4, sedangkan produksi dimer dan monomer terus berlanjut sampai jam ke-8. Tingkat produksi trimer dan dimer pada perlakuan ChiB + ChiC meningkat dibanding dengan reaksi secara individual pada 4 jam pertama (Tabel 2.2). Penambahan ChiA pada kombinasi ChiB + ChiC sedikit menurunkan laju awal produksi trimer walaupun hasil akhir dari produk tidak terpengaruh karena peningkatan laju produksi selanjutnya. Pengaruh antara efek penambahan CBP dan Chb terhadap kombinasi 2 atau lebih kitinase ditunjukan pada Gambar 2.6.

 

Keterangan : (a) Chitotriose [trimer (GlcNAc)3]; (b) Chitobiose [dimer (GlcNAc)2] dan (c) N-acetylglucosamine [monomer (GlcNAc)]

 

Gambar 2.6 Efek sinergis penambahan CBP dan Chb terhadap produk akhir berupa trimer (GlcNAc)₃, dimer (GlcNAc)₂ dan monomer (GlcNAc) dalam reaksi yang mengandung dua atau lebih kitinase (Gutiérrez-Román et al.,2014)

 

Penambahan Chb pada reaksi yang mengandung ChiB dan atau ChiC meningkatkan produksi dimer dan trimer dibandingkan dengan reaksi secara individu, namun sangat menurunkan produksi monomer. Dengan demikian Chb meningkatkan tingkat awal produksi trimer, menurunkan laju pembentukan monomer dan hanya meningkatkan tingkat produksi dimer dalam kombinasi dengan ChiB atau ChiC. Pada kombinasi ChiB + ChiC, Chb memperpanjang durasi fase logaritmik produksi trimer (Gambar 2.5a).

Kombinasi antara CBP dengan ChiB + ChiC hanya meningkatakan produksi trimer dan dimer. Dengan demikian dapat disimpulkan bahwa CPB bersifat katalis inaktif dan hanya bertindak untuk memodifikasi struktur kitin sehingga terjadi peningkatan pada aksesibilitas kitinase. Reaksi yang mengandung ChiA + ChiB + ChiC + CBP mengurangi produksi dimer secara signifikan dan pembentukan monomer yang meningkat. Efek dari Chb dan CBP pada aktivitas ChiB + ChiC berubah akibat adanya ChiA. Pembentukan dimer dan trimer secara signifikan menurun pada reaksi ChiB + ChiC + Chb saat ChiA hadir. Perlakuan kombinasi semua enzim kitinase (ChiA+ChiB+ChiC) dengan CBP dan Chb menunjukan tingkat pembentukan produk dan hasil akhir yang paling tinggi dibandingkan dengan kombinasi lainnya. Dalam kombinasi ini, pembentukan trimer pada dasarnya linier sepanjang waktu, sedangkan kurva pembentukan monomer dan dimer menunjukkan peningkatan yang signifikan.

Tuveng et al. (2017) mencoba menganalisis mekanisme kitinolitik pada Serratia marcescens BJL200. Berdasarkan analisis secara genomic, ditemukan jenis kitinase baru yang disebut Chi D (kitinase D) dengan jumlah produksinya yang sangat rendah. Gen dari ChiD diklon pada E. coli BL21 kemudian dimurnikan dan dibandingkan kemampuannya dalam mendegragasi kitin secara individu maupun kombinasi dengan ChiA, ChiB dan ChiC. Pengujian kemampuan degradasi kitin menguunakan reaksi standar yang  mengandung 15 g/l α-chitin, 15 g/l β-chitin dalam 20 mM BisTris pH 6.0. Reaksi diinkubasi dalam  thermomixer at 40 °C, 800 rpm dan produk hasil degradasi dianalisis dengan menggunakan Rezex RFQ-Fast Acid H + (8%) kolom ion-exclusion (Phenomenex, CA, USA) dipasang pada Dionex Ultimate 3000 HPLC dengan deteksi UV. Profil produk yang dihasilkan oleh masing-masing kitinase dan kombinasinya ditunjukan pada Gambar 2.7

Keterangan : A1 menunjukan produk N-acetylglucosamine dan A2 menunjukan produk N,N′-diacetylchitobiose

Gambar 2.7 Profil produk yang dihasilkan dari α-chitin oleh masing-masing kitinase ChiA, ChiB, ChiC serta ChiD dan kombinasinya. (Tuveng et al., 2017)

 

Gambar 2.7 menunjukan bahwa aktivitas dari ChiD pada  α-chitin  sangat kecil dibandingkan dengan kitinase Serratia marcesacens lainnya. Namun dibandingkan dengan kitinase lainnya, ChiD menutupi celah substrat yang dapat mempengaruhi sifat kataliknya. ChiD mampu mengubah N, N’-diasetil chitobiose menjadi N-asetil glukosamin, namun kurang efisien daripada enzim lain yang diproduksi untuk tujuan ini seperti Chitobiase. Dengan demikian, peran ChiD dalam degradasi chitin belum memiliki hasil yang signifikan. Kombinasi dari kitinase ChiA, ChiB dan ChiC menghasilkan produk dimer (N-diasetilkitobiose) yang relatif sama dengan kombinasi ChiA, ChiB, Chi dan ChiD. Namun pada hasil monomer (N-asetilglukosamin), kombinasi ChiA, ChiB, Chi dan ChiD  memiliki hasil yang lebih tinggi. Penambahan kitinase ChiD pada semua kombinasi terbukti meningkatkan hasil monomer meskipun tidak sebanyak yang dihasilkan oleh Chb.

Mekanisme aktivitas sinergis pada proses hidrolisis kitin bakteri Serratia marcescens dimulai saat ChiC sebagai endokitinase mendegradasi polimer menjadi oligomer dengan menghidrolisis ikatan glikosida β-(1,4) sehingga dihasilkan produk chitotriose (trimer) (Muzzarelli, 1999). Pada proses ini CBP (Chitin Binding Protein) memotong kristal kitin serta mengubah struktur kitin sehingga meningkatkan aksesbilitas dari substrat (Suzuki et al., 1998). Kemudian ChiA dan ChiB sebagai eksokitinase mendegradasi oligomer menjadi chitobiosa (dimer) yang bekerja pada ujung pereduksi (Muzzarelli, 1999) . Chitobiase yang merupakan β-N-asetilglukosaminidase bekerja pada pemutusan chitobiosa (dimer) dengan menghasilkan monomer-monomer N-Asetilglukosamin (Uchiyama et al. 2003). Mekanisme aktivitas sinergis pada proses hidrolisis kitin bakteri Serratia marcescens ditunjukan oleh Gambar 2.8.

Gambar 2.8 Mekanisme aktivitas sinergis pada proses hidrolisis kitin bakteri Serratia marcescens

• PENUTUP

 

• Kesimpulan

1. Terdapat aktivitas sinergis dalam pendegradasian senyawa kitin menjadi produk Trimer, Dimer dan Monomer. Perlakuan kombinasi semua enzim kitinase (ChiA+ChiB+ChiC) dengan CBP dan Chb menunjukan tingkat pembentukan produk dan hasil akhir yang paling tinggi dibandingkan dengan kombinasi lainnya.
2. Mekanisme aktivitas sinergis pada proses hidrolisis kitin dimulai saat ChiC sebagai endokitinase mendegradasi polimer menjadi oligomer dengan menghidrolisis ikatan glikosida β-(1,4) sehingga dihasilkan produk chitotriose (trimer). Pada proses ini CBP memotong kristal kitin serta mengubah struktur kitin sehingga meningkatkan aksesbilitas dari substrat. Kemudian ChiA dan ChiB sebagai eksokitinase mendegradasi oligomer menjadi chitobiosa (dimer) yang bekerja pada ujung pereduksi. Chitobiase dan ChiD yang merupakan β-N-asetilglukosaminidase bekerja pada pemutusan chitobiosa (dimer) dengan menghasilkan monomer-monomer N-Asetilglukosamin.

 

 

• Saran

Pelu adanya studi lebih lanjut mengenai mekanisme sinergis semua enzim kitinase yang meliputi ChiA, ChiB, ChiC dan ChiD serta Chitobiase dan CBP (Chitin Binding Protein) pada berbagai macam substrat seperti α-chitin, β-chitin dan koloidal kitin. Hal tersebut karena setiap enzim memiliki spesifitas substrat yang berbeda.

 

 

DAFTAR PUSTAKA

 

Bhattacharya D, Nagpure A, Gupta RK. 2007. Bacterial chitinases: properties and potential. Crit Rev Biotech. 27(1):21-28.

Brurberg, M.B., B. Synstad. D.M.F Aalten.,L. Sundheim., S.S. Klemsdal.,  and V.G.H. Eijsink. 2000. Chitinases from Serratia marcescens. Manuscript ‘Recent Research Developments in Microbiology.

Chakrabortty, S., S.  Bhattacharya,  and A. Das. 2012. Optimization of Process Parameters for Chitinase Production by a Marine Isolate of Serratia marcescens. International Journal of Pharmacy and Biological Sciences. 2(2): 2230-7605.

Chen, J.K., C.R. Shen, and  C.L.  Liu. 2010. N-Acetylglucosamin: Production and Applications. Marine Drugs. 8: 2493-2516.

Davies, D dan Bernard, H. 1995. Structures and mechanisms of glycosyl hydrolases. Minireview. Currrent Biology. 3:853-859.

Gooday, G.W. 1990. Physiology of Microbial Degradation of Chitin and Chitosan. Biodegradation. 1: 177-190.

Gutiérrez-Román, M. Michael, F., Raunel, T., Francisco, H., Graciela, H., Karina, G. 2014. Potentiation of the synergistic activities of chitinases ChiA, ChiB and ChiC from Serratia marcescens CFFSUR-B2 by Chitobiase (Chb) and chitin binding protein (CBP). World J Microbiol Biotechnol. 30:33–42.

Horn, S.J., M. Sorlie, G. Vaaje-Kolstad, A.L. Norberg, B. Synstad, K.M. Varum, and V.G.H. Eijsinkl. 2006. Comparative Studies of Chitinases A, B and C from Serratia marcescens. Biocatalysis and Biotransformation. 24(1/2): 39-53.

Khusniati,  T., N. Widhyastuti, I.  Saskiawan, A. Choliq,  dan  R. Handayani. 2012. Peningkatan  Kualitas Produk Susu dengan N-Asetilglukosamina dan β-Galaktosidase di Jawa.  Tim Pelaksana Insentif Peningkatan  Kemampuan  Peneliti dan Perekayasa. Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia.

Muharni, 2010. Isolasi dan Identifikasi  Bakteri  Penghasil  Kitinase  dari  Sumber  Air  Panas  Danau  Ranau  Sumatera  Selatan.  Universitas  Sriwijaya.  Sumatera  Selatan.  Jurnal  Penelitian Sains. 10:06-09.

Murray, T. A. and Sandford. 2003. Chitin and Chitosan: Sources, Chemistry, Biochemistry, Physical Properties and Application. Elsevier Applied Science. London, pp. 561.

Muzzarelli, R.A.A and P. Jolles. 1999. Chitin and Chitinases. Birkhauser, Bassel.

Naumoff, D.G. 2011. Hierarchical Classification of Glycoside Hydrolases. Biochemistry.  76(6) : 622-635.

Ohno, T., S. Armand, T. Hata, N. Nikaidou, B. Henrissat, M. Mitsutomi, and T. Watanabe. 1996. A Modular Family 19 Chitinase Found in The Prokaryotic Organism Streptomyces griceus HUT 6037. Journal of Bacteriology. 178(17): 5065-5070.

Pratiwi, R.S., T.E. Susanto, Y.A.K. Wardani, dan A. Sutrisno. 2015. Chitinase and The Aplication in Industry: A Review. Jurnal Pangan dan Agroindustri. 3(3): 878-887.

Suzuki, K., Suzuki, M., Taiyoji, M., Nikaidou, N.,Watanabe T. 1998 Chitin binding protein (CBP21) in the culture supernatant of Serratia marcescens 2170. Biosci Biotechnol Biochem 62:128–135.

Suzuki, N., Noriko, S., Megumi, S. 2002. Chitinases A, B and C1 of Serratia marcescens 2170 Produced by Recombinant E. coli: Enzymatic Properties and Synergism on Chitin Degradation. Bioci. Biotechnol. Biochem. 66 (5), 1075-1083.

Synowiecki, J., and Al-Khateeb, N.A. 2003. Production, Properties, and Some New Applications of Chitin and its Derivatives. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 43, no.2, 145-171.

Tharanathan, R.N.,& Kittur, F.S. 2003. Chitin – The Undisputed biomolecule of great potential. Critical Reviews in Food Science and Nutritional, 43: 61 – 87

Uchiyama, T., Katouno, F., Nikaidou, N., Nonaka, T., Sugiyama, J., Watanabe, T. 2001 Roles of the exposed aromatic residues in crystalline chitin hydrolysis by chitinase A from Serratia marcescens 2170. J Biol Chem 276:41343–41349.

Winarno, F.G. 1986. Enzim Pangan. Gramedia. Jakarta.

Wirawan, A dan Nuniek, H. 2013. Penentuan Waktu Inkubasi pada Pembentukan Senyawa N-Asetilglukosamin yang Didegradasi Secara Enzimatis dari Kitin. UNESA Journal of Chemistry. 2(3): 11-13.

Yurnaliza. 2002.  Senyawa Khitin dan Kajian Aktivitas Enzim Mikrobial Pendegradasinya. Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sumatra Utara. Kajian Pustaka.