Latar belakang
Kitin merupakan salah satu komponen yang kelimpahannya paling banyak di alam setelah selulosa. Beberapa jenis hasil perikanan yang menjadi sumber kitin diantaranya yaitu cangkang udang, cangkang kepiting dan tulang cumi-cumi. Kitin dapat didegragasi menjadi monomer N-asetilglukosamin oleh enzim kitinase. Serratia marcescens adalah salah satu bakteri yang dapat menghasilkan enzim kitinase.
Faktor yang mempengaruhi produksi enzim kitinase pada bakteri S. marcescens diantaranya yaitu suhu, pH, jenis karbon dan sumber nitrogen. Sumber karbon (C) dan jenis nitrogen (N) pada bakteri digunakan untuk suplai nutrisi sebagai sumber energi. Sumber karbon dan jenis nitrogen dapat menurunkan atau meningkatkan aktivitas kitinase, tergantung pada kesesuaiannya terhadap preferensi bakteri.
Biokonversi kitin menjadi N-asetilglukosamin (NAG) agar didapatkan produk yang banyak memerlukan berbagai kondisi optimal. Penelitian yang telah dilakukan menunjukan bahwa suhu optimum dan pH optimum untuk menghasilkan produk NAG yaitu pada suhu 30℃ dan pH 7. Sementara untuk sumber karbon paling baik yaitu pati dan jenis nitrogen paling baik adalah yeast extract. Namun demikian, rasio konsentrasi antara karbon dan nitrogen untuk menghasilkan produk NAG yang diinginkan belum diketahui secara pasti. Oleh karena itu penelitian mengenai rasio konsentrasi antara karbon dan nitrogen perlu dilakukan agar biokonversi kitin cangkang udang menjadi N-asetilglukosamin dapat menghasilkan produk NAG yang makasimal.
Tujuan
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh rasio konsentrasi karbon dan nitrogen dalam biokonversi kitin menjadi N-asetilglukosamin serta untuk mengetahui rasio optimal antara konsentrasi karbon dan nitrogen dalam menghasilkan N-asetilglukosamin oleh Serratia marcescens PT 6.
Metode
1. Alat dan Bahan
1.1 Alat
Alat yang akan digunakan untuk penelitian ini meliputi jarum ose, spatula, korek api, bunsen, loyang, pengaduk, kertas pH, pH meter, yellow tip, blue tip, microtube 1,5 mL, microtube 2 mL, rak tabung reaksi, termometer, pipet ukur, gelas ukur, gelas beker, botol gelap, corong kaca, tabung reaksi, cawan petri, micropipet, erlenmeyer 100 mL, erlenmeyer 250 mL, erlenmeyer 1 L, erlemeyer 2 L, panci, timbangan analitik, vortex, kompor, hot plate stirer, autoklaf, oven, penggiling tepung, waterbath shaker, incubator shaker, refrigated centrifuge, sentrifuge, mesin FTIR (Fourier Transform Infra Red), spektrofotometer dan refrigerator.
1.2 Bahan
Bahan yang akan digunakan dalam penelitian ini antaralain cangkang udang kering, karet gelang, kertas layang, kertas label, isolasi, plastik, kapas, NaOH, HCl, NaOCl, akuades, K2HPO4, KH2PO4, MgSO4.5H2O, ZnSO4, MnCl2, agar bacteriological, kitin dari cangkang udang, NaH2PO4.H2O, Na2HPO4.12H2O, N-asetilglukosamin, p-dimetilaminobenzaldehida, glukosa, laktosa, pati, yeast extract, asam asetat glasial, dan potassium borat.
2. Tata Laksana
Penelitian ini dilakukan melalui tahap persiapan yang meliputi pembuatan kitin, pembuatan koloidal kitin, pembuatan kitin agar dan kitin cair dan pembuatan inokulum bakteri. Kemudian biokonversi kitin menjadi N-asetilglukosamin oleh Serratia marcescens PT 6 pada berbagai rasio konsentrasi karbon dan nitrogen. Rancangan penelitian yang digunakan yaitu Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan 3 ulangan. Penelitian ini akan dilaksanakan di Laboratorium Mutu dan Kemanana Hasil Perikanan, Laboratorium Hidrobiologi, Laboratorium Teknologi Pengolahan Ikan, Laboratorium Penyakit Ikan Departemen Perikanan Fakultas Pertanian serta Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia di Bandung.
2.1 Persiapan
2.1.1 Pembuatan Kitin
Cangkang udang basah dicuci bersih kemudian dikeringkan dengan cara dijemur dibawah sinar matahari selama 3 hari untuk mengurangi kadar air pada cangkang udang. Pembuatann kitin melalui 3 tahap yaitu deproteinasi, demineralisasi dan depigmentasi. Deproteinasi dilakukan dengan memasukan 100 gram cangkang udang ke dalam erlenmeyer 2 L yang berisi NaOH 1N dan dipanaskan di atas hot plate stirer pada suhu 60℃ selama 1 jam sambil diaduk. Endapan yang dihasilkan kemudian dicuci dengan air mengalir sampai mencapai pH netral kemudian dikeringkan menggunakan oven pada suhu 60℃ selama 24 jam. Demineralisasi dilakukan dengan memasukan cangkang hasil deproteinasi ke dalam erlenmeyer 2 L yang berisi HCl 1N dengan perbandingan cangkang udang : HCl 1N sebesar 1:15. Campuran tersebut diinkubasi pada suhu ruang selama 2 jam sambil diaduk selama 1 menit setiap 10 menit sekali. Tahap depigmentasi dilakukan denagn memasukan hasil demineralisasi kedalam erlenmeyer 2 L dan direndam dengan NaOCl 0,315% selama 5 menit dengan perbandingan cangkang udang : NaOCl 0,315% sebesar 1:15. Kitin dicuci bersih hingga mencapai pH netral kemudian dioven selama 24 jam dengan suhu 60℃. Kitin yang dihasilkan diayak menggunakan ayakan 20 mesh dan dilakukan pengujian FTIR (Fourier Transform Infra Red).
2.1.2 Pembuatan Koloidal Kitin
Kitin sebanyak 20 gram dimasukan kedalam 150mL HCl 12 N dan dihomogenkan dengan hot plate stirer selama 60 menit tanpa menggunakan panas. Hasil yang diperoleh disaring menggunakan glasswoll. Endapan yang diperoleh dimasukan ke dalam erlenmeyer 1 L yang berisi 800mL akuades dingin dan disimpan pada suhu 4℃ selama 24 jam. Koloidal kitin yang didapat dicuci dengan cara mengganti air dalam erlenmeyer beberapa kali hingga pH netral. Setelah koloidal kitin netral, selanjutnya koloidal kitin diambil dengan cara disentrifuge dengan kecepatan 6000 rpm pada suhu 4℃ selama 10 menit.
2.1.3 Pembuatan Medium Kitin Agar Cair dan Kitin Cair
Secara umum terdapat 2 jenis bahan yang digunakan, yaitu bahan utama dan mineral. Bahan utama terdiri dari K2HPO4 0m07%, KH2PO4 003%, koloidal kitin 2% dan agar 2 %. Sedangkan bahan mineral terdiri dari MgSO4.5H2O 0,05%, ZnSO4 0,0001%, dan MnCl2 0,0001%. Kedua jenis bahan tersebut dilarutkan dalam akuades sampai homogen dan distrelisasi menggunakaa autoklaf dengan suhu 121℃ selama 15 menit. Pembuatan kitin cair sama seperti pembuatan kitin agar namun tidak ada penambahan agar pada bahan utama.
2.1.4 Pembuatan Inokulum Bakteri
Pembuatan inokulum bakteri dimulai dengan pembuatan kultur kerja yang merupakan sediaan bakteri yang digunakan untuk persediaan koloni tunggal selama penelitian berlangsung. Pembuatan kultur kerja melalui tahap penyegaran dan streak ulang bakteri. Pembuatan inokulum bakteri dilakukan dengan mengambil 1 koloni tunggal dari kultur kerja dan diinokulasikan pada 7 mL medium kitin cair. Selanjutnya bakteri diinkubasi pada incubator shaker selama 3 hari, 30℃, 100 rpm.
2.2 Biokonversi kitin menjadi N-asetilglukosamin oleh Serratia marcescens PT 6 pada berbagai rasio konsentrasi karbon dan nitrogen
Biokonversi kitin menjadi N-asetilglukosamin oleh Serratia marcescens PT 6 pada berbagai rasio konsentrasi karbon dan nitrogen dilakukan untuk mengetahui pengaruh kombinasi terhadap hasil NAG dan untuk menentukan rasio konsentrasi optimal. Jenis karbon yang digunakan yaitu pati dan sumber nitrogen yang digunakan yaitu yeast extract. Rasio kombinasi karbon (C) dan nitrogen (N) yang digunakan didasarkan pada penelitian yang telah dilakukan oleh Xia et al., (2011) yaitu 2:1, 1:1, 2:3, 3:2, 4:1 dan 4:3. Medium yang digunakan pada percobaan ini yaitu medium kitin cair (kontrol) dan mediium kitin cair yang diberi perlakuan berbagai rasio konsentrasi. Tahap ini dimulai dengan mensuspensikan 225 µl inokulum bakteri kedalam 100mL erlenmeyer yang berisi 45mL kitin cair dan diinkubasi pada suhu 30℃ dengan pH 7 dan diberi perlakuan masing-masing rasio kombinasi selama 7 hari dengan agitasi 70 rpm pada waterbath shaker.
3. Parameter Uji
Parameter uji yang dilakukan pada penelitian ini meliputi aktivitas kitinase, konsentrasi N-asetilglukosamin dalam medium, pertumbuhan bakteri, dan pH medium yang dihasilkan. Masing-masing parameter uji dilakukan setiap 24 jam sekali pada setiap perlakuan dan ulangannya.
4. Analisi Data
Analisis data dilakukan secara deskriptif, yaitu dengan memberikan gambaran suatu peristiwa melalui pengamatan secara langsung (observasi) dan mengidentifikasi hubungan sebab akibat yang terjadi. Data kuantitatif yang diperoleh dari perhitungan secara matematis ditampilkan dalam bentuk tabel dan grafik serta dianalisis secara deskriptif.
