a. Total Phenolic Compound
Pengukuran kandungan fenol total pada ekstrak dilakukan dengan menggunakan pereaksi Folin-Cio-calteu mengikuti prosedur Das et al. (2012) dengan sedikit modifikasi. Standar yang digunakan adalah asam galat. Dibuat 100 ppm larutan ekstrak. Larutan ekstrak tersebut diambil 1,0 ml dengan menggunakan pipet volume dan kemudian dimasukkan ke dalam labu ukur 10,0 ml. Kedalam labu ukur 10,0 ml tersebut ditambahkan 500 μl pereaksi Folin-Ciocalteu, lalu dikocok hingga homogen selama 1 menit. Sebelum menit kedelapan, ditambahkan 4,0 ml Na2CO3 7,5% b/v, dikocok selama 1 menit dan ditambahkan aquades dan dikocok hingga homogen. Selanjutnya dilakukan pengukuran dengan spektrofotometer pada panjang gelombang maksimum dan waktu optimum untuk pengukuran asam galat. Hasil pengukuran ini dinyatakan sebagai berat setara dengan asam galat tiap berat ekstrak. Perhitungan kandungan fenolik total menggunakan rumus berikut (Samin et al., 2010):
Ket. :
c = konsentrasi Fenolik (nilai x)
v = volume ekstrak yang digunakan (ml)
fp = Faktor pengenceran
g = Berat sampel yang digunakan (g)
b. Uji aktivitas antioksidan dpph
Metode sederhana yang digunakan dalam pengujian aktivitas antioksidan adalah metode spektrofotometri menggunkan DPPH. Metode ini lebih mudah digunakan dan memerlukan waktu yang singkat ( Hanani, E, 2005). Hasil penelitian produk teh daun pacar air dengan variasi lama fermentasi dan metode pengeringan mengandung aktivitas antioksidan yang cukup tinggi.
Pengujian aktivitas penangkapan radikal DPPH dilakukan mengikuti modifikasi metode Mun’im et al. 2003. Secara garis besar ekstrak dibuat dalam berbagai larutan dalam methanol. Sebanyak 1,0 ml ekstrak dimasukkan kedalam wadah selan jutnya ditambahkan 1 ml larutan DPPH (100 ppm). Selanjutnya tambahkan methanol 4,0 ml dan dihomogenkan mennggunakan vortex. Larutan ini diinkubasi pada 37°C selama 30 menit. Selanjutnya serapannya diukur pada panjang gelombang 517 nm. Persentase inhibisi dihitung dengan menggunakan rumus sebagai berikut:
c. Uji betacaroten
Penentuan beta karoten secara Spektrofotodensitometri menurut Parwata et al., (2010) sebagai berikut :
1. Pembuatan Larutan Standar beta karoten
Larutan standar beta karoten 100 ppm dipipet sebanyak 1 mL dan dimasukkan ke dalam labu ukur 10 mL, kemudian dilarutkan dalam petroleum eter sampai tanda batas. Konsentrasi larutan standar beta karoten yang diperoleh adalah 10 ppm.
2. Penyiapan Sampel
Sebanyak 17,08 gram sampel dimaserasi dengan metanol sampai semua madu terendam dalam pelarut selama ± 24 jam, selanjutnya filtrat disaring. Filtrat yang diperoleh diuapkan pada tekanan rendah dengan suhu 60 – 700oC menggunakan penguap putar vakum (rotatory evaporator) hingga diperoleh ekstrak pekat metanol. Sebanyak 1 gram ekstrak pekat metanol ditambah 10 mL aseton kemudian dipartisi dengan menggunakan corong pisah, proses ini diulang sebanyak 2 kali.
3. Pemisahandengan Kromatografi Lapis Tipis
Pemisahan komponen kimia dalam filtrat aseton dengan menggunakan kromatografi lapis tipis bertujuan untuk mencari fase gerak terbaik yang akan digunakan dalam KLT-Spektrofotodensitometri. Adsorben yang dipergunakan dalam KLT adalah silika gel F254 dan fase geraknya adalah campuran beberapa pelarut. Beberapa variasi campuran pelarut pengembang digunakan sebagai berikut : campuran aseton : etil asetat (3:7), campuran klorofom : etil asetat (7:3).Filtrat aseton dilarutkan ke dalam sedikit pelarut, kemudian larutan diambil dengan mengunakan pipa kapiler dan ditotolkan pada plat kromatografi lapis tipis. Plat dimasukkan dalam bejana kromatografi yang sebelumnya telah dijenuhkan dengan uap fase gerak. Masing-masing noda yang terbentuk diamati dengan lampu UV 254 nm dan dihitung harga Rf-nya. Fase gerak yang memberikan noda terbanyak dengan jarak pemisahan yang cukup atau perbedaan Rf yang cukup besar akan digunakan pada KLT-Spektrofotodensitometri.
4. Uji kualitatif beta karoten
Plat KLT Silika Gel F254 yang berukuran 20 x 20 cm dicuci dengan metanol. Chamber dijenuhkan dengan larutan pengembang selama kurang lebih 1 jam sebelum digunakan untuk mengelusi. Sebanyak 4 µL, 6 µL, 8 µL dan 10 µL larutan standar 10 ppm sehingga menghasilkan jumlah penotolan sebagai berikut : 40 ng, 60 ng, 80 ng dan 100 ng yang ditotolkan pada pita pertama, kedua, ketiga, keempat, sedangkan masing-masing 4 µL sampel madu ditotolkan pada pita terakhir. Penotolan standar dan sampel pada plat dilakukan dengan mengunakan linomat IV yang telah diprogram dengan jarak 10 mm dari tepi bawah plat dan pita pertama 10 mm dari tepi kiri plat dengan lebar masing-masing pita 3 mm. Kemudian noda dielusi menggunakan campuran pelarut etil asetat : kloroform dengan perbandingan (3 : 7) dengan pegembangan menaik, sampai 90 mm dari tepi bawah plat. Setelah plat dielusi kemudian dikeringkan dalam oven pada suhu 1100oC selama 10 menit. Noda dilihat dibawah lampu UV dengan 254 nm. Noda kromatogram dirajah dibawah TLC Scanner 3 pada max.
5. Penentuan kadar beta karoten
Masing-masing 4 µL sampel ditotolkan pada plat. Penotolan dilakukandengan menggunakan Linomat IV danpengembangan plat dikerjakan dengan cara yang sama seperti pada prosedur 3.4.3.4. Luas puncakkromatogram dibaca pada panjang gelombang maksimum dibawah TLC Scanner 3. Pekerjaanini diulang sebanyak 3 kali. Hasil yang diperolehdigunakan untuk menentukan kadar beta karotendengan menggunakan persamaan garis regreslinier y = bx + a, dengan rumus :
DAFTAR PUSTAKA
Das AK, Rajkumar V, Verma AK, and Swarup D. 2012. Moringa oleiferaleaves extract: a natural antioxidant for retarding lipid peroxidation in cooked goat meat patties. Inter J Food Sci Technol, 47:585-591.
Hanani, E, 2005 dalam Subiyandono. 2011. “Uji aktivitas antioksidan ekstrak Camelia sinensis, Hibiscus sabdariffa, dan Phaleria macrocarpa (scheff) Boerl, Secara spektrofotometri dengan DPPH”. Jurnal Kesehatan. Politeknik Kesehatan Palembang. Vol I No 7.
Mun’im A, Negishi O, and Ozawa T. 2003. Antioxidative compounds from Crotalaria sessiliflora. Biosci Biotechnol Biochem, 67(2): 410-414.
Parwata ,I M., K. Ratnayani, dan Ana L.2010. Aktivitas Antiradikal Bebas Serta Kadar Beta Karoten Pada Madu Randu (Ceiba Pentandra) Dan Madu Kelengkeng (Nephelium Longata L.). JURNAL KIMIA 4 (1): 54-62
Samin, Adi Ahmad, Nurhayati Bialangi, Yuszda K. Salimi. 2010. PENENTUAN KANDUNGAN FENOLIK TOTAL DAN AKTIVITASANTIOKSIDANDARI RAMBUT JAGUNG (ZEA MAYS L.)YANG TUMBUH DI DAERAH GORONTALO. Pharmaҫiana, Vol. 2, No. 1.
